蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法：微量凱氏定氮法
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。
微量凱氏定氮法【實(shí)驗(yàn)原理】
凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到量、濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。
蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。
微量凱氏定氮法【實(shí)驗(yàn)材料】
1.實(shí)驗(yàn)器材
微量凱氏定氮儀1套；50ml凱氏燒瓶4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠
2.試驗(yàn)試劑
(1)濃硫酸；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01mol／L)。
(2)粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物：K2SO4與CuSO4·5H2O以3：1配比研磨混合。
(3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50ml0.1％甲烯藍(lán)乙醇溶液與200ml0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。
(4)樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。
【實(shí)驗(yàn)操作】
1.安裝凱氏定氮儀。
2.消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品1ml，催化劑(K2SO4-CuSO4·5H2O)200mg，濃硫酸5ml。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1ml蒸餾水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化。
在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。
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